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ELISPOT 技术简介
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简介ELISPOT技术
  
  ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay,其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜,用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含sodium azide、内毒素endotoxin)的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分离处理后,会被分配到微孔盘上,再接受适当的抗原刺激,并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言,记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素,此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后,被捕获的细胞激素可进一步使用生物素(Biotin)标记的二次抗体来标志,其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用,并加入酵素受质使其呈色,有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。

ELISPOT技术的过去


  ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky 等人率先在1983年,运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛,每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫,其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境,藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子,来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大小,同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。
  ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单,但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在ex vivo T细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题,便是灵敏度的提升,因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想,成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题,使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点,结果是敏感度不够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用(Forsthuber et al., Science, 1996),才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比,PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体,使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏,让呈色斑点集中、清晰、对比色高,大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。图一是使用PVDF-BASED改良薄膜(Panel A)与传统标准薄膜(Panel B)并行实验的比较结果。同样的人体 PBMC样品,在通过完全相同的实验,Panel A呈现较清晰的小色点。

  第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证,也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题,诸如;   

  • 实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产,还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应?
  • 斑点的小或大有何生理意义;如何决定cutoff值?
  • 能否相信斑点是由单一的细胞造成? · ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围? · 如果效应相互拮抗的cytokine同时产生,它们是否会互相妨碍?及到什么程度?


  • ELISPOT 技术的现在
      

      1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁等技术改良,ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待,它已是当世公认最灵敏抗原特定T细胞的体外检测技术。藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹,ELISPOT 分析技术可提示T细胞免疫系统的两个重要参数:抗原特定T细胞的clone族群大小;和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2。

      多年来经过数十个研究团队的致力研究,对于ELISPOT分析技术本身的几个问题,也有了科学上的验证。目前一般公认,ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞,主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。在适当的实验设计下,ELISPOT Cytokine 斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成,同时斑点形态学与Time Response分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。也因为如此,ELISPOT是个免疫学上的标竿技术,它可以允许科研人员在几乎自然生理条件下,观察细胞实际分泌Cytokine的进程,进而可以得到药理学信息,阐明免疫调节药物如何影响T细胞分泌各类cytokine的速率。药物抑制T细胞免疫一般可通过两程截然不同的机转;使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小,或减少每Precursor T细胞的cytokine产能,而ELISPOT技术能提供双份信息。

            上图:典型Elispot Plate Layout 右图:实验结果

      ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特定T细胞免疫学上独占鳌头。此技术是当世唯一准许百万分之一1:1000,000的准确分析,如此强效的解析力使流式细胞技术也望其项背,以目前国内外常规的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色,流式技术的灵敏度一般限制在1:10,000。这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究是必须的,因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频率通常低于万中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球,解冻后PMBC与新鲜分离样品有相当的效价,没有丧失功能。这一点对临床试验非常重要,它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样,如果试验牵涉全国多个临床试验机构,病人血样可冰存并同时集中在「中央实验室」一齐被测试。同理,一个血样或标准对照品可被分装小份,被送到不同检验中心进行测试,以交互比对,同时有利LISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化。

    流式细胞intracellular cytokine技术之灵敏度仅是万中取一


    ELISPOT 斑点的判读
      

      像多数的Cell-based分析技术一样,ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止,以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之激素分泌,仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以;有时就算有专职技师判读,使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见,而有所偏颇。

      科学实证的本质,在于如何使实验结果能尽可能客观、精确、同时有高重现性,传统的人工计算法显然无法达到此一要求。故而有几个科研团队使自行开发Plate Scanner与自动分析软件,其中以Paul Lehmann教授研究开发之ImmunoSpot? Analyzer自动分析仪最具代表性。分析ELISPOT实验数据的过程中,仪器先以高分辨率镜头捕捉微小孔中膜上呈色影像,而后储存成TIF檔;这些影像可以进一步使用手动、或是自动方式计算斑点数目,如果使用ImmuneSpot分析软件,可以先设定条件,然后同时分析斑点的大小,以推估激素分泌的多寡。预料像ImmunoSpot? Analyzer这一类自动图像扫描分析仪器,将可克服传统显微镜判读方法耗费人力、及人为客观性等缺点,彻底解除ELISPOT分析技术的瓶颈问题,进一步推广该技术的新颖应用。

      ImmunoSpot@影像扫描分析仪可以提供不同的数据格式,包括未处理与处理过的膜表面影像、每个小孔中的斑点数目、每个小孔中的平均斑点数目、每个小孔中斑点大小的直方统计图。


    ELISPOT 未来展望
      

      据笔者的观察,ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能,它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学,就像是心脏外科医师手上的那张心电图,经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统,在那里视察、发掘,得到全新的智识。

      从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求,并被广泛地应用在多项领域,包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000),以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中,被当成重要的终结指针。2003年1月,世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作,将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术,该计划将是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。


    其它ELISPOT应用范围
      
  • 移植研究 – allograft rejection

  • 疫苗开发 -亦可评估疫苗效力,或是疫苗注射路径影响
  • Th0/Th1/Th2细胞转换分析
  • 自体免疫研究 – 免疫调节及免疫治疗研究
  • 癌症研究 -肿瘤反应T细胞作用
  • 过敏机制探讨 – IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换,其它参与过敏机制之细胞激素研究
  • 传染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等
  • 抗原决定位定图
  • 体液免疫力研究 – B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究


  • 参考文献
      

       Czerkinsky, C.C., L.A. Nilsson, H. Nygren, O. Ouchterlony, and A. Tarkowski. 1983. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J. Immunol. Meth. 65: 109.
       Forsthuber, T., H.C. Yip, and P.V. Lehmann. 1996. Induction of TH1 and TH2 immunity in neonatal mice. Science. 271: 1728-1730 (Tab. 1). 7
    Fujihashi, K., J. McGhee, K. Beagley, D. McPherson, S. McPherson, C.-M. Huang, and H. Kiyono. 1993. Cytokine-specific ELISPOT assay: single cell analysis of IL-2, IL-4, and IL-6 producing cells. J. Immunol. Meth. 160: 181-189.
       Herr W, Linn B, Leister N, Wandel E, Meyer zum Buschenfelde KH, Wolfel T. 1997. The use of computer-assisted video image analysis for the quantification of CD8+ T lymphocytes producing tumor necrosis factor alpha spots in response to peptide antigens. J Immunol Methods. 203(2):141-52.
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       Lewis JJ, Janetzki S, Schaed S, Panageas KS, Wang S, Williams L, Meyers M, Butterworth L, Livingston PO, Chapman PB, Houghton AN. 2000. Evaluation of CD8(+) T-cell frequencies by the Elispot assay in healthy individuals and in patients with metastatic melanoma immunized with tyrosinase peptide. Int J Cancer. 87(3):391-8.
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