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  我们提出了当代细胞因子 ELISPOT 方案。
  在病理教授Paul V. Lehmann, M.D., Ph.D.的领导下,一群通过网络进行协作的学者们在Case Western Reserve 大学(CWRU)提出了一种全新的 ELISPOT 分析方法,并且取得了专利。最初的 ELISPOT 协议用于检测抗体引导的B细胞。由于 T 细胞产生的抗体要比 B 细胞产生的要少得多,我们改进的方法是进行细胞因子的 ELISPOT 分析法最关键、最有力的工具。

  Paul V. Lehmann 博士 ELISPOT 的细胞因子分析上发表了20篇以上的论文,建立了 ELISPOT 分析的科学基础。

 
   图中显示使用 Immunospot 协议后进行IFN-r ELISPOT分析后的改进效果。将新分离的外周血液中的单核细胞置于介质和破伤风类毒素记忆抗原中同时培养 24 个小时。请留意使用 Immunospot 方案后,背景噪声减少,同时有用的信号得到放大。

CTL 公司的 ELISPOT 分析仪与同类产品相比,具有以下技术优势:


1. 强大的区分单个细胞能力

2. 并排展示 ELISPOT 板扫描图片和计数图片结果,方便对比观察和初步判断实验结果好坏

3. 可半定量分析,也可以把照片打印出来分析,作为实验室文献的原始记录

4. 数据优化:为了不漏掉细胞尤其是 ImmunoSpot 板边缘的细胞,分析仪采取了自动居中 auto center 的特点

5. 自动照明系统对照明进行了优化 , 使成像不受灯光反射等干扰,另外 CTL 提供一种特殊品牌的 ImmunoSpot 板,以满足客户的要求

6. 针对客户的需要,提供多种扫描和计数参数供客户设置

  每个细胞因子通过 ImmunoSpot 分析斑点形状不同。如 TNF- α和 IFN- γ或者 IL-2 的斑点,是 T 细胞在不同的动力学基础上产生的,斑点形状根本不同。而且,不同的斑点成像代表不同细胞因子。比如具有不同属性或不同膜结合能力的抗体对会影响 IFN- γ斑点形状,即使相同抗体之间的批间差异或者不同底物对于斑点的大小和密度仍有影响。因此精确的图像分析必须和各种各样的斑点形状相对应。

  一旦针对所有特殊的细胞因子分析变量确定,实验之间的差异会最小。所以对于 ELISPOT 数据分析关键是建立针对特定实验条件的计数参数。一旦这些参数建立,保存为模板,他们就会在无限的分析中提供准确的结果,只要试验条件没有变化。重要的是,参数不必针对不同的刺激物类型如培养基种类,抗原种类,不同模体或者细胞密度变化而变化。

可供设置的参数有:

  扫描分辨率 resolution
  计数分辨率 resolution
  灵敏度 sensitivity
  背景平衡 background balance
  最大最小斑点面积 minimum spot size
  融合斑点的区分 process for diffuse spots
  斑点区分程度 spot separation tolerance
  相互覆盖的斑点处理 overdeveloped area processing

  建立和保存实验参数以后,计数会自动进行,以后的实验可以调用曾经使用的参数。

7. 质控系统:

  对于肉眼认为的伪点( bad area )可以在质控中手动剔除并选择性标记,对于质控中没有列出的质控条款,客户可以自己添加

8. 计数结果:

  标准的数据输出结果是保存在 TXT 文件中每孔斑点数和平均斑点尺寸,其它的包括为了肉眼控制自动机数设计的 Excel 输出、每个孔斑点尺寸柱状图、原始成像图、计数结果。而且,如果肉眼控制时发现伪点(头发、细胞膜挂擦等),可以手动去处。

9. 数据处理

  ELISPOT 可以进行高流量的数据获取和分析。要求很低的细胞浓度(~ 100,000 - 300,000 细胞每孔),低容量的 50ulELISPOT 板。数百个样品可以平行分析。对于 IL-2,4,5 和 IFN γ如果冰冻和解冻方法正确的话,不会影响实验结果。对于临床试验来说,可以纵向采集标本,不同的地点采集标本以后在指定实验室一起分析。

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